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PCR反應(yīng)體系構(gòu)建引物應(yīng)遵循的原則

點擊次數(shù):1816次  更新時間:2020-10-26
  PCR(Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)體系是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。具有易自動化\特異、敏感、產(chǎn)率高、簡便、快速、重復(fù)性好等突出優(yōu)點;能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA的片段于在數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷;或者可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中,擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去需要幾天甚至幾星期才能做到的事情,用PCR技術(shù)只需在幾小時以內(nèi)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項創(chuàng)舉和里程碑。
  PCR反應(yīng)體系構(gòu)建中引物是特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核昔酸鏈作引物,利用PCR就可將模板DNA在體外擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系構(gòu)建

  PCR反應(yīng)體系構(gòu)建引物應(yīng)遵循的原則:
  1.引物長度:15-30bp,常用為20bp左右;
  2.引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性;
  3.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3’端的互補(bǔ),否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶;
  4.引物堿基:G+C含量以40%-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC一般隨機(jī)分布,避免5個以上的嚎吟或e陡核昔酸的成串排列;
  5.引物3’端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗;
  6.引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴(kuò)增的靶序列一般要有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處;
  7.引物擴(kuò)增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
  引物量:每條引物的濃度0.1-1μmol/L或10-l00pmol/L,以Z 低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。
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